Вадкасная храматаграфія з'яўляецца асноўным метадам праверкі ўтрымання кожнага кампанента і прымешак у сыравіне, прамежкавых прадуктах, прэпаратах і ўпаковачных матэрыялах, але для многіх рэчываў няма стандартных метадаў, на якія можна спадзявацца, таму распрацоўка новых метадаў непазбежная. Пры распрацоўцы вадкасных метадаў храматаграфічная калонка з'яўляецца ядром вадкаснай храматаграфіі, таму выбар падыходнай храматаграфічнай калонкі мае вырашальнае значэнне. У гэтым артыкуле аўтар растлумачыць, як выбраць калонку для вадкаснай храматаграфіі з трох аспектаў: агульныя ідэі, меркаванні і сфера прымянення.
А. Агульныя ідэі выбару калонак вадкаснай храматаграфіі
1. Ацаніце фізічныя і хімічныя ўласцівасці аналіту: такія як хімічная структура, растваральнасць, стабільнасць (напрыклад, ці лёгка акісляецца/аднаўляецца/гідралізуецца), кіслотнасць і шчолачнасць і г.д., асабліва хімічная структура з'яўляецца ключом фактар, які вызначае такія ўласцівасці, як кан'югаваная група мае моцнае ультрафіялетавае паглынанне і моцную флуарэсцэнцыю;
2. Вызначце мэту аналізу: ці патрабуецца высокая сепарацыя, высокая эфектыўнасць калонкі, кароткі час аналізу, высокая адчувальнасць, устойлівасць да высокага ціску, працяглы тэрмін службы калонкі, нізкі кошт і г.д.;
- Выберыце прыдатную храматаграфічную калонку: зразумейце склад, фізічныя і хімічныя ўласцівасці храматаграфічнага напаўняльніка, такія як памер часціц, памер пор, дапушчальнасць да тэмпературы, дапушчальнасць да pH, адсорбцыя аналізаванага рэчыва і г.д.
- Меркаванні для выбару калонак вадкаснай храматаграфіі
У гэтай главе будуць абмяркоўвацца фактары, якія неабходна ўлічваць пры выбары храматаграфічнай калонкі з пункту гледжання фізічных і хімічных уласцівасцей самой храматаграфічнай калонкі. 2.1 Матрыца напаўняльніка
2.1.1 Матрыца з сілікагелю Напаўняльнікам большасці калон вадкаснай храматаграфіі з'яўляецца сілікагель. Гэты тып напаўняльніка мае высокую чысціню, нізкі кошт, высокую механічную трываласць і лёгка мадыфікуе групы (напрыклад, фенільныя сувязі, амінасувязі, цыяна сувязі і г.д.), але значэнне рн і дыяпазон тэмператур, якія ён пераносіць, абмежаваныя: Дыяпазон pH большасці матрычных напаўняльнікаў з сілікагелем складае ад 2 да 8, але дыяпазон pH спецыяльна мадыфікаваных фаз, звязаных з силикагелем, можа дасягаць ад 1,5 да 10, і ёсць таксама спецыяльна мадыфікаваныя фазы, звязаныя з силикагелем, якія стабільныя пры нізкім pH, такія як Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, які стабільны пры pH ад 1 да 8; верхняя мяжа тэмпературы матрыцы силикагеля звычайна складае 60 ℃, а некаторыя храматаграфічныя калонкі могуць вытрымліваць тэмпературу 40 ℃ пры высокім pH.
2.1.2 Палімерная матрыца Палімерныя напаўняльнікі ў асноўным складаюцца з полістырол-дывінілбензолу або поліметакрылату. Іх перавагі ў тым, што яны могуць пераносіць шырокі дыяпазон pH - іх можна выкарыстоўваць у дыяпазоне ад 1 да 14, і яны больш устойлівыя да высокіх тэмператур (можа дасягаць вышэй за 80 °C). У параўнанні з напаўняльнікамі C18 на аснове дыяксіду крэмнія, гэты тып напаўняльніка мае больш моцную гідрафобнасць, а макрапорісты палімер вельмі эфектыўны пры падзеле ўзораў, такіх як бялкі. Яго недахопы складаюцца ў тым, што эфектыўнасць калоны ніжэй і механічная трываласць слабей, чым у напаўняльнікаў на аснове кремнезема. 2.2 Форма часціц
Большасць сучасных напаўняльнікаў ВЭЖХ ўяўляюць сабой сферычныя часціцы, але часам яны маюць нерэгулярныя часціцы. Сферычныя часціцы могуць забяспечыць больш нізкі ціск у калоне, больш высокую эфектыўнасць калоны, стабільнасць і больш працяглы тэрмін службы; пры выкарыстанні высокавязкіх рухомых фаз (напрыклад, фосфарнай кіслаты) або калі раствор пробы глейкі, нерэгулярныя часціцы маюць вялікую ўдзельную плошчу паверхні, што больш спрыяе поўнаму дзеяння дзвюх фаз, і цана адносна нізкая. 2.3 Памер часціц
Чым меншы памер часціц, тым вышэй эфектыўнасць калоны і вышэй падзел, але тым горш супраціў высокаму ціску. Часцей за ўсё выкарыстоўваецца калонка з памерам часціц 5 мкм; калі патрабаванні да падзелу высокія, можна выбраць напаўняльнік памерам 1,5-3 мкм, які спрыяе вырашэнню праблемы падзелу некаторых складаных матрычных і шматкампанентных узораў. UPLC можа выкарыстоўваць напаўняльнікі памерам 1,5 мкм; Напаўняльнікі з памерам часціц памерам 10 мкм і больш часта выкарыстоўваюцца для полупрепаративных або прэпаратаў калонак. 2.4 Утрыманне вугляроду
Утрыманне вугляроду адносіцца да долі звязанай фазы на паверхні сілікагеля, якая звязана з удзельнай плошчай паверхні і ахопам звязанай фазы. Высокае ўтрыманне вугляроду забяспечвае высокую ёмістасць калонкі і высокае разрозненне і часта выкарыстоўваецца для складаных узораў, якія патрабуюць высокага падзелу, але з-за доўгага часу ўзаемадзеяння паміж дзвюма фазамі час аналізу доўгі; храматаграфічныя калонкі з нізкім утрыманнем вугляроду маюць больш кароткі час аналізу і могуць паказваць розныя селектыўнасці, і часта выкарыстоўваюцца для простых узораў, якія патрабуюць хуткага аналізу, і ўзораў, якія патрабуюць высокіх умоў воднай фазы. Як правіла, утрыманне вугляроду ў C18 вагаецца ад 7% да 19%. 2.5 Памер пор і ўдзельная плошча паверхні
Адсарбцыйныя асяроддзя ВЭЖХ - гэта порыстыя часціцы, і большасць узаемадзеянняў адбываецца ў порах. Такім чынам, малекулы павінны патрапіць у пары, каб адсарбавацца і аддзяліцца.
Памер пор і ўдзельная плошча паверхні - два ўзаемадапаўняльныя паняцці. Малы памер пор азначае вялікую ўдзельную паверхню, і наадварот. Вялікая ўдзельная плошча паверхні можа павялічыць узаемадзеянне паміж малекуламі ўзору і звязанымі фазамі, палепшыць утрыманне, павялічыць загрузку ўзору і ёмістасць калонкі, а таксама падзел складаных кампанентаў. Да гэтага віду напаўняльнікаў ставяцца цалкам кіпрыя напаўняльнікі. Тым, хто мае высокія патрабаванні да падзелу, рэкамендуецца выбіраць напаўняльнікі з вялікай удзельнай паверхняй; невялікая ўдзельная плошча паверхні можа знізіць супрацьціск, павысіць эфектыўнасць калонкі і паменшыць час раўнавагі, што падыходзіць для градыентнага аналізу. Да гэтага віду напаўняльнікаў ставяцца напаўняльнікі ядро-абалонка. Зыходзячы з перадумовы забеспячэння падзелу, рэкамендуецца выбіраць напаўняльнікі з невялікай удзельнай плошчай паверхні для тых, хто мае высокія патрабаванні да эфектыўнасці аналізу. 2.6 Аб'ём пор і механічная трываласць
Аб'ём пор, таксама вядомы як «аб'ём пор», адносіцца да памеру аб'ёму пустэчы на адзінку часціцы. Ён можа добра адлюстроўваць механічную трываласць напаўняльніка. Механічная трываласць напаўняльнікаў з вялікім аб'ёмам пор некалькі слабей, чым у напаўняльнікаў з малым аб'ёмам пор. Напаўняльнікі з аб'ёмам пор меншым або роўным 1,5 мл/г у асноўным выкарыстоўваюцца для падзелу з дапамогай ВЭЖХ, а напаўняльнікі з аб'ёмам пор больш за 1,5 мл/г у асноўным выкарыстоўваюцца для малекулярна-эксклюзійнай храматаграфіі і храматаграфіі нізкага ціску. 2.7 Хуткасць укупорки
Кэппінг можа паменшыць пікі хвастоў, выкліканыя ўзаемадзеяннем паміж злучэннямі і адкрытымі сіланольнымі групамі (напрыклад, іённыя сувязі паміж шчолачнымі злучэннямі і сіланольнымі групамі, сілы Ван-дэр-Ваальса і вадародныя сувязі паміж кіслотнымі злучэннямі і сіланольнымі групамі), тым самым паляпшаючы эфектыўнасць калонкі і форму піка . Незакрытыя звязаныя фазы будуць ствараць розныя селектыўнасці адносна закрытых звязаных фаз, асабліва для палярных узораў.
- Сфера прымянення розных калонак вадкаснай храматаграфіі
У гэтай главе будуць апісаны сферы прымянення розных тыпаў калонак вадкаснай храматаграфіі ў некаторых выпадках.
3.1 Храматаграфічная калонка C18 з зваротнай фазай
Калонка C18 з'яўляецца найбольш часта выкарыстоўванай калонкай са зваротнай фазай, якая адпавядае тэстам на ўтрыманне і прымешкі большасці арганічных рэчываў і прымяняецца да сярэднепалярных, слабапалярных і непалярных рэчываў. Тып і тэхнічныя характарыстыкі храматаграфічнай калонкі C18 павінны выбірацца ў адпаведнасці з канкрэтнымі патрабаваннямі да падзелу. Напрыклад, для рэчываў з высокімі патрабаваннямі да падзелу часта выкарыстоўваюцца спецыфікацыі 5 мкм * 4,6 мм * 250 мм; для рэчываў са складанымі раздзяляльнымі матрыцамі і падобнай палярнасцю можна выкарыстоўваць спецыфікацыі 4 мкм*4,6 мм*250 мм або меншыя памеры часціц. Напрыклад, аўтар выкарыстаў калонку 3 мкм * 4,6 мм * 250 мм для выяўлення двух генатаксічных прымешак у API целекоксиба. Падзел двух рэчываў можа дасягаць 2,9, што выдатна. Акрамя таго, у адпаведнасці з перадумовай забеспячэння падзелу, калі патрабуецца хуткі аналіз, часта выбіраюць кароткі слупок 10 мм або 15 мм. Напрыклад, калі аўтар выкарыстаў ВХ-МС/МС для выяўлення генатаксічных прымешак у піперахінафасфатным API, выкарыстоўвалася калонка 3 мкм*2,1 мм*100 мм. Падзел паміж прымешкай і асноўным кампанентам склаў 2,0, і выяўленне ўзору можа быць завершана за 5 хвілін. 3.2 Фенільная калонка з зваротнай фазай
Фенільная калонка таксама з'яўляецца тыпам калонкі з зваротнай фазай. Гэты тып калоны мае моцную селектыўнасць для араматычных злучэнняў. Калі рэакцыя араматычных злучэнняў, вымераная звычайнай калонкай C18, слабая, вы можаце разгледзець магчымасць замены калонкі з фенілам. Напрыклад, калі я рабіў целекоксиб API, адказ асноўнага кампанента, вымераны калонкай з фенілам таго ж вытворцы і той жа спецыфікацыі (усе 5 мкм * 4,6 мм * 250 мм), быў прыкладна ў 7 разоў большы, чым у калонцы C18. 3.3 Слупок нармальнай фазы
У якасці эфектыўнага дадатку да калонкі з зваротнай фазай калонка з нармальнай фазай падыходзіць для высокапалярных злучэнняў. Калі пік па-ранейшаму вельмі хуткі пры элюіраванні з больш чым 90% воднай фазай у калонцы са зваротнай фазай і нават блізкі да піку растваральніка і перакрываецца з ім, вы можаце разгледзець магчымасць замены калонкі з нармальнай фазай. Гэты тып калонак уключае калонку з хілам, калонку з амінакіслотамі, калонку з цыяна і г.д.
3.3.1 Гілікавая калонка Гілікавая калонка звычайна ўбудоўвае гідрафільныя групы ў звязаны алкільны ланцуг для павышэння рэакцыі на палярныя рэчывы. Гэты тып калонкі падыходзіць для аналізу цукровых рэчываў. Аўтар выкарыстаў гэты тып калонкі, калі рабіў змест і роднасныя рэчывы ксілозы і яе вытворных. Ізамеры вытворнага ксілозы таксама можна добра падзяліць;
3.3.2 Амінакалонка і цыянакалонка Амінакалонка і цыянакалонка адносяцца да ўвядзення амінакалонкі і цыянамадыфікацый на канцы звязанага алкільнага ланцуга, адпаведна, для павышэння селектыўнасці для спецыяльных рэчываў: напрыклад, амінакалонка з'яўляецца добрым выбарам для падзелу цукроў, амінакіслот, асноў і амідаў; циановая калонка мае лепшую селектыўнасць пры падзеле гідрагенізаваных і негидрированных структурна падобных рэчываў за кошт наяўнасці спалучаных сувязяў. Амінакалонка і калонка цыяна часта могуць пераключацца паміж калонкай нармальнай фазы і калонкай са зваротнай фазай, але частае пераключэнне не рэкамендуецца. 3.4 Хіральная калона
Хіральная калонка, як вынікае з назвы, падыходзіць для падзелу і аналізу хіральных злучэнняў, асабліва ў галіне фармацэўтыкі. Гэты тып калонкі можна разглядаць, калі звычайныя калонкі са зваротнай фазай і нармальнай фазай не могуць дасягнуць падзелу ізамерый. Напрыклад, аўтар выкарыстаў 5 мкм*4,6 мм*250 мм хіральную калонку для падзелу двух ізамераў 1,2-дыфенілетылендыяміну: (1S, 2S)-1,2-дыфенілетылендыямін і (1R, 2R)-1,2 -дифенилэтилендиамин, і падзел паміж імі дасягнуў каля 2,0. Аднак хіральныя калоны каштуюць даражэй, чым іншыя тыпы калон, звычайна 1 Вт+/шт. Калі ёсць патрэба ў такіх калонах, падраздзяленню трэба зрабіць дастатковы бюджэт. 3.5 Іонаабменных калонка
Іонаабменныя калонкі падыходзяць для падзелу і аналізу зараджаных іёнаў, такіх як іёны, бялкі, нуклеінавыя кіслоты і некаторыя цукровыя рэчывы. Па тыпу напаўняльніка яны падзяляюцца на катионообменные калоны, анионообменные калоны і моцныя катионообменные калоны.
Катыённыя калонкі ўключаюць калонкі на аснове кальцыя і вадароду, якія ў асноўным падыходзяць для аналізу катыённых рэчываў, такіх як амінакіслоты. Напрыклад, аўтар выкарыстаў калонкі на аснове кальцыя пры аналізе глюконата кальцыя і ацэтату кальцыя ў прамыўным растворы. Абодва рэчывы мелі моцную рэакцыю пры λ = 210 нм, а ступень падзелу дасягала 3,0; аўтар выкарыстоўваў калонкі на аснове вадароду пры аналізе рэчываў, звязаных з глюкозай. Некалькі асноўных роднасных рэчываў - мальтоза, мальтотрыоза і фруктоза - мелі высокую адчувальнасць пад дыферэнцыяльнымі дэтэктарамі з мяжой выяўлення ўсяго 0,5 праміле і ступенню падзелу 2,0-2,5.
Аніённыя калонкі ў асноўным падыходзяць для аналізу аніённых рэчываў, такіх як арганічныя кіслоты і іёны галагенаў; моцныя катыёнаабменныя калонкі маюць больш высокую іонаабменную здольнасць і селектыўнасць і падыходзяць для падзелу і аналізу складаных узораў.
Вышэй - гэта толькі ўвядзенне ў тыпы і вобласці прымянення некалькіх распаўсюджаных калонак вадкаснай храматаграфіі ў спалучэнні з уласным вопытам аўтара. Існуюць іншыя спецыяльныя тыпы храматаграфічных калонак у рэальным прымяненні, такія як храматаграфічныя калонкі з вялікімі порамі, храматаграфічныя калонкі з дробнымі порамі, калонкі для афіннай храматаграфіі, шматмодавыя храматаграфічныя калонкі, калонкі для вадкаснай храматаграфіі звышвысокай прадукцыйнасці (UHPLC), калонкі для звышкрытычнай вадкаснай храматаграфіі ( SFC) і г. д. Яны гуляюць важную ролю ў розных галінах. Канкрэтны тып храматаграфічнай калонкі павінен быць абраны ў адпаведнасці са структурай і ўласцівасцямі пробы, патрабаваннямі да падзелу і іншымі мэтамі.
Час публікацыі: 14 чэрвеня 2024 г